ゴールデン レトリバー 里親

ゴールデンレトリバー【愛知県・女の子・2022年5月25日・ゴールド】元気な可愛いらしい子です。|みんなのブリーダー(子犬ID:2207


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タイトル: 特許公報(B2)_新規なラクトバチルス属菌株、たんぱく質及びそのシークエンスならびにこれらの菌株、たんぱく質及びシークエンスの利用法
出願番号: 1994235912
年次: 2005
IPC分類: 7,C12N1/20,A61K35/74,A61K38/46,C07K14/335,C07K16/40,C12N9/52,C12N15/09,C12P21/08

佐々木 正弘 ボーキャ ボスマン パリス ソム チャン タン JP 3618122 特許公報(B2) 20041119 1994235912 19940905 新規なラクトバチルス属菌株、たんぱく質及びそのシークエンスならびにこれらの菌株、たんぱく質及びシークエンスの利用法 雪印乳業株式会社 000006699 藤野 清也 100090941 佐々木 正弘 ボーキャ ボスマン パリス ソム チャン タン NL 9301525 19930903 20050209 7 C12N1/20 A61K35/74 A61K38/46 C07K14/335 C07K16/40 C12N9/52 C12N15/09 C12P21/08 C12N1/20 C12R1:225 C12N9/52 C12R1:225 JP C12N1/20 A A61K35/74 A C07K14/335 C07K16/40 C12N9/52 C12P21/08 A61K37/54 C12N15/00 A C12N1/20 C12R1:225 C12N9/52 C12R1:225 7 C12N 1/20 ZNA A61K 35/74 A61K 38/46 C07K 14/335 C07K 16/40 C12N 9/52 C12N 15/09 JSTPlus(JOIS) BIOSIS/WPI(DIALOG) MEDLINE(STN) J Gen Microbiol. ,1993年 5月,Vol.139 ( Pt 7),p.1441-1448 6 FERM BP-5445 1995274949 19951024 27 20010209 左海 匡子 【0001】【産業上の利用分野】本発明は、高たんぱく質分解力および苦味除去能を有し、ラクトバチルス ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus) に属する新規な乳酸菌、特にSBT 2171株及びその培養物に関する。さらに、本発明は、この乳酸菌より得られるたんぱく質分解酵素及びその利用法に関する。本発明の乳酸菌、培養物あるいはこれから得られるたんぱく質分解酵素を、食品、飼料および医薬品のたんぱく質の分解過程で利用することにより、これらの製品を、人および動物に対して苦みおよび臭気がなく、安全で、しかも低コストで製造することが可能となる。従って本発明は、食品、飼料および医薬の分野で利用することができる。【0002】【従来の技術】従来、たんぱく質を分解する方法は様々な方法がある。酸による分解、酵素による分解、微生物による分解などである。酸による分解は、製造コストを低く抑えることができるが、酸を使用するので利用できる製品は制限される。また、食品への応用には、人および動物に対する安全性が問題であり、たとえ、その安全性が科学的に証明されたとしても、消費者は、心理的に拒否反応を示すことが多い。トリプシン、ペプシンなどの消化酵素を用いた場合は、高たんぱく質分解力をもつために比較的製造コストを低く抑えることができる。しかも、安全性の問題は回避できるが、これら消化酵素は、苦味のもととなるペプチドを生じさせるため、風味を劣化させ、良質な風味をもつ製品を製造できない。また、微生物を利用する方法は、微生物の種類によって、その安全性に問題を残す。安全な微生物とは、伝統的発酵食品に含まれているもので、古来より人類が食し、これまでに何ら問題のないものとされている。その代表的なものに、酪農乳酸菌がある。しかし、チーズに広く用いられている乳酸球菌は、たんぱく質分解活性が低いため、製造コストが高くなる欠点がある。【0003】【発明が解決しようとする課題】チーズに広く用いられている乳酸球菌は、人および動物に対する安全性は高いが、たんぱく質分解力が低いために、製造コストが高くなり、産業上適用範囲が制限される。また、一部の酪農乳酸菌は、たんぱく質分解力は高いが、苦味を生じさせ、製品の風味を損なわせるものが存在する。従って、本発明の目的は、安全性の高い酪農乳酸菌のなかから、たんぱく質分解力が高く、しかも苦味および臭気除去能を有する酪農乳酸菌及びたんぱく質分解酵素を提供することにある。【0004】【問題を解決するための手段】本発明者らは、乳および乳製品より分離した乳酸桿菌のたんぱく質分解力および苦味除去能を詳細に比較研究した結果、高いたんぱく質分解力および苦味除去能を有するラクトバチルス ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus) SBT 2171株を獲得し、本発明を完成した。【0005】すなわち、本発明は、発酵乳を滅菌した生理食塩水に懸濁し、さらに滅菌した生理食塩水で菌株106 〜107 となるように希釈した懸濁液を調製する。この懸濁液を市販のMRS 培地に寒天を1.5 %になるように加えたMRS 寒天培地に塗沫し、37℃で2日以上培養する。こゝで出現するコロニーを採取してMRS 培地に接種し、37℃で1日間培養し、後記するようなスクリーニングを行い、その活性の最も高い菌株を採取し、継代培養を行った。こゝで得られた株の菌学的特徴は次のとおりであった。【0006】【表1】【0007】この菌学的性質から、Bergy’s manual of systematic bacteriology Vol. 2,pp. 1222−1224(1986) の記載を参酌して検索すると、この菌株は、ラクトバチルス ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus) と同定された。そして得られた菌株をラクトバチルス ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT 2171 としてオランダCeutraalbureau voor Schimmelcultures(CBS) に受託番号CBS 404.93として寄託した。なお、この菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にラクトバチルス ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT 2171(FERM P−14381) として寄託され、その後ブタペスト条約に基づく寄託に移管された。そして、受託番号FERM BP−5445が付されている。以下、本発明を詳細に説明する。【0008】材料と方法この乳酸菌を取得するためのスクリーニングは以下のように行った。微 生 物乳および乳製品から分離された乳酸桿菌12菌種168 株及び乳酸球菌9株のたんぱく質分解力および苦味除去能を比較した。比較した菌種名および菌株数は以下のものである。【0009】これらの標準菌株は、ナショナル コレクション オブ フード バクテリア(National Collection of Food Bacteria, NCFR)、アグリカルチュラル アンドフード リサーチ カウンセル(Agricultural and Food Research Council)及び英国のイスティチュート オブ フード リサーチ(Institute of Food Research)より取得したものである。また、後のSBT番号を付した菌株は、雪印乳業 (株) 標準菌株コレクション(Snow Brand Type Culture Collection)より得たものである。【0010】Lactococcus lactis ssp. cremoris AM1、E8、HP、SK112 並びにWg2 、及びLactococcus lactis ssp. lactis ML3はオランダ、Ede にあるネザーランド インスティチュート フォー デアリー リサーチ(NIZO)(Netherland Institute for Dairy Research) より入手した。微生物は常法で3 世代に亘りMRS 培地(Merck 、Darmstadt 、ドイツ)を用い30または37℃で継代培養し、10%(v/v) グリセリン含有MRS 培地中、−55 ℃で保存した。【0011】成長曲線各菌株から、成長曲線は保存菌株(stock−culture )からMRS 培地またはMRX 培地10 ml 中に第1 世代を1%種培養(seed−culture)して得て、第2 世代の前培養(preculture)に継代した。次いでMRS 培地 10 mlを含有するねじ込み栓付13 x 150mm試験管にその1%を接種した。菌の成長は波長650 nmで吸光度(OD)を測定して観察した。【0012】無菌体抽出液の調製MRS 液体培地400 ml中で成長した細胞菌体は、対数増殖期の後期に、4 ℃、7,500 x G で10分間遠心分離して回収し、10 mM 塩化カルシウムを含有する50mM4−(2− ヒドロキシエチル)−1−ピペラジン− エタンスルホン酸〔4−(2−hydroxyethyl)−1−piperazine−ethanesulfonic acid (HEPES) 〕100ml 、pH 7、で洗浄し、この緩衝液10 ml 中に懸濁させた。2次スクリーニングの為に、菌株は塩化カルシウム 15 mMを含有するDe Man et al.(7)のHugenholtz etal. (15) 変法培地であるMRX 培地で成長させた。菌体抽出物は菌体を超音波破砕器(Vibra Cell: Sonics & Materials Inc. 、米国、コネチカット州、Danbury )で、出力50% 、パルス20% 、0 ℃、10分間間隔、10分間超音波処理で破壊して得た。無菌体抽出液は破壊した菌体を30,000 xG、4 ℃、10分間遠心分離で得た。【0013】酵素アッセイたんぱく質分解活性は、Lactococcus 菌種について記載されている種々のたんぱく質分解酵素に対応する広範な合成した色素産生(chromogenic) 基質を用いて測定した(表2参照)。p−ニトロアニリド(Nitroanilide)を含有する基質の加水分解は、Exterkate(12) の方法で測定した。酵素混合物は菌体抽出物20μl 及び100 mM HEPES 200μl 、pH 7とした。反応は2 mM p− ニトロアニリド(nitroanilide)基質溶液 200μl を添加して開始し、30℃に数分間保持した。反応は52%(v/v)酢酸100 μl を添加して終了させた。反応混合物は14,000 rpmで5 分間遠心分離し、上清中のp−ニトロアニリド(nitroanilide)の量は410 nmで測定した(U−2000 spectrophotometer.日立製作所、日本)。p−ニトロアニリド (Nitroanilide) の濃度はモル吸収係数(molar absorption coefficient) (ε= 8,800 M−1 m−1) より算出した。【0014】β− ナフチルアミド(Naphthylamide) 基質の加水分解はElleman(11) の変法で測定した。酵素混合物は菌体抽出物20μl 及び100 mM HEPES 200μl 、pH 7とした。反応は 2 mM β− ナフチルアミド(Naphthylamide) 基質水溶液 200μl を添加して開始し、30℃で数分間インキュベートした。反応はFast Garnet GBC 1 mg/ml 及び5%(w/v)Brij 35を含有する1M 酢酸塩 200μl 、pH 4.0、を添加して終了させた。反応混合物は最適な発色を示す迄10分間保持し、次いで14,000 rpmで5 分間遠心分離した。上清中のβ− ナフチルアミド(Naphthylamide) の量は550 nmで測定した(U−2000 spectrophotometer, 日立製作所、日本)。β− ナフチルアミド(Naphthylamide) の濃度はモル吸収係数(ε = 20,000 M−1 m−1) より算出した。【0015】非色素非産生性(non−chromogenic) 合成ペプチドの加水分解はDoi et al.(8)のcadmium−ninhydrin 法の変法に依る遊離アミノ酸の放出で測定した。酵素混合物は100 mM HEPES(pH 7)中、希釈菌体抽出物100 μl を含有させて調製した。反応は2 mMペプチド溶液100 μl を添加して開始させ、30℃で数分間反応させた。反応はCd Ninhydrin試薬 1.5 ml を添加して終了させ、次いで84℃で5 分間加熱した。冷却後、反応混合物は14,000 rpmで5 分間遠心分離し、吸光度はVitalab 10 spectrophotometer(Vital Scientific、Dieren、オランダ)を用いて515 nmで測定した。ペプチダーゼの比活性は、測定条件下の1 分間当り基質からのL−ロイシン(leucine)1μモルに相当するアミノ酸を生成するに要する酵素量と定めた(26)。【0016】Resorufin 標識カゼイン(Boehringer Mannheim GmbH、ドイツ)の加水分解は、50 mM HEPES 中、37℃で、製造者によって示されたプロトコールに従って測定した。すべての試験混合物は反応開始前に30℃に調整した。【0017】【表2】【0018】APIZYM試験方法APIZYMキット(LAR ZYM AP 1〜6 )はAPI SYSTEM(La Balme Les Grottes、フランス)から得た。たんぱく質65または125 mg/ml を含有し、菌体抽出液または無菌体抽出液70μl を、脱水した色素産生酵素基質を含有する各ウエルに添加し、混合物を37℃で 2または4 時間反応させた。反応はZYM A 試薬50μl の添加で終了させ、ZYM B 試薬50μl の添加で発色させた。酵素活性は5分間の発色を製造者から提供されたカラーチャートと比較して測定した。【0019】SDS−PAGEドデシル硫酸ナトリウム− ポリアクリルアミド ゲル(SDS−PAGE)及びプレパラティブスラブ ゲル電気泳動は、それぞれMini−Protean II 及び Protean II Xi(Bio−Rad Laboratories、Richmond、カリフォルニア州)を用いて、製造者の提供したインストラクションマニュアルに記載の通り実施した。酵素分子の大きさは予め染色した14,400〜97,400 Da の標準SDS−PAGE(Bio−Rad Laboratories、Richmond、カリフォルニア州)を用いて測定した。【0020】イムノブロット法(Immunoblotting)ゲル上に分離したたんぱく質は、Mini Trans−Blot Cell(Bio−Rad Laboratories、Richmond、カリフォルニア州)を用いて、製造者のマニュアルに記載の通りポリビニリデン ジフルオライド(polyvinylidene difluoride 、PVDF)シートに転写した。PVDF膜は1%スキムミルクで飽和し、種々のたんぱく質分解酵素に対する抗体、即ちポリクローナル及びモノクローナル抗体を、それぞれ1/4,000 〜1/8,000 及び1/10希釈液と共に反応させた。反応物は150 mM塩化ナトリウム及び0.05% Tween−20を含有する10 mM トリス塩酸(pH 8.0)(TBST)、で洗浄後、膜は1/3,000 に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ イムノグロブリン血清またはヤギ抗マウス(Bio−Rad Laboratories、Richmond、カリフォルニア州)と反応させた。【0021】PVDF膜はTBSTで洗浄し、酵素抗体複合体は、0.1 M NaHCO3及び1.0 mM MgCl2から成るpH 9.8のカーボネート緩衝液中70% ジメチルフォルムアミド中の30 mg/mlの1%(v/v) ニトロブルーテトラゾリウム(Nitroblue tetrazolium) 及び100%ジメチルフォルムアミド中の15 mg/mlの1%(v/v) 5−ブロモ−4− クロロ−3− インドリルフォスフェート ジソジウム塩(5−bromo−4−chloro−3−indolylphosphate disodium salt) と反応させて発色させた。抗体はGroningen 大学、微生物学部(オランダ)より得た(14,18,27)。【0022】ポリアクリルアミド ゲル上のペプチダーゼ活性の検出無菌体抽出液中のたんぱく質は7.5%プレパラティヴ スラブ ゲル電気泳動で分離した。ゲルは垂直に7 mmのゲル片に切断し0.1 mM HEPES、(pH 7)、で10分間2 回洗浄した。ゲル片は1mM β− ナフチルアミド(Naphthylamide) 基質を含有する100 mM HEPES 10 ml中、37℃で2 〜60分反応させた。ペプチダーゼ活性は、Fast Gamet GBC 2mg/ml 水溶液10mlの添加後 5分以内に発色測定した(Sarah et al.)。もしくは、ペプチダーゼ活性は、ゲル片中に、o−ジアニシジン(dianisidine) を酸化して赤褐色に発色する複合酵素反応でロイシンを検出することで測定した。ゲル片は100 mM HEPES (pH 7.5)8 ml 、50 mM Leu−Leu またはLeu−Leu−Leu 溶液 160μl 、0.1N HCl中23.3 mM o−ジアニシジン(dianisidine)80 μl 、3.2 M (NH4)2SO4 中5,000 U/mlパーオキシダーゼ(peroxidase)80μl 及び3.2 M (NH4)2SO4 中 1 mg/ml L− アミノ酸オキシダーゼ80μl を含有する溶液8.4 ml中で、37℃、10分間反応させた。【0023】官能テストトリプシン消化カゼインを含有する25 mM 燐酸カリウム(pH 7)、及び菌体抽出たんぱく質 0.5 mg の混合物2ml を、30℃で6時間反応させた。カゼイン消化物の苦味は、6名のパネルに依る官能試験で評価した。苦味に変化がなければ「苦い」、苦味が残れば「僅かに苦い」、また苦味が感じられなければ「完全に苦味を除去した」として表わした。【0024】種々のペプチダーゼの部分精製FPLCに依るMono−Qイオン交換クロマトグラフィーの精製条件は、以下の様に設定した:無菌体抽出物4mgを含む溶液 100μl を、Mono−Q HR 5/5 カラム(Pharmacia LKB 、Uppsala 、スウェーデン)に吸着させた。酵素活性は20 mM Tris塩酸緩衝液(pH 8.0)の0.15〜0.5M塩化ナトリウムの直線的濃度勾配(linear gradient) で、流速1 ml/ 分に依り溶出し、溶出液は1 ml毎に採取し、種々の (色素産生) ペプチドを用いてペプチダーゼ活性を検定した。【0025】たんぱく質測定たんぱく質濃度はウシ血清アルブミンをスタンダードとしてBio−Rad Protein Assay (Bio−Rad Laboratories 、Richmond、カリフォルニア州、米国)により測定した。【0026】化学薬品及び試薬本発明で使用した全てのアミノ酸及びペプチド誘導体は、特に規定のある外は、L−体のアミノ酸である。全ての化学薬品は試薬規格で、市販品を用いた。【0027】結 果Lactobacillus 及びLactococcus の178 菌株のスクリーニングLactobacillus 及びLactococcus の178 菌株の無菌体抽出液は、更に13の亜種に分類し、以下の基質を用いてそのたんぱく質分解活性をテストした:ジェネラルアミノペプチダーゼ活性にはLys−pNA 及びArg−pNA 、グルタミル アミノペプチダーゼ活性にはGlu−pNA 、プロリダーゼ活性にはPro−pNA 、X−プロリル− ジペプチジル アミノペプチダーゼ活性にはAla−Pro−pNA 、エンドペプチダーゼまたはプロティナーゼ活性にはSuc−Phe−pNA 及びMeO−Suc−Arg−Tyr−pNA を用いた。【0028】図1 は基質、Lys−pNA 、図2 は基質、Ala−Pro−pNA 、及び図3 は基質、MeO−Suc−Arg−Pro−Tyr−pNA に対する、各菌別のたんぱく質分解活性の平均を示し、最大及び最小値も示した。結果は各菌種に非常に多様なたんぱく質分解活性を明瞭に示した。高い活性も見出されたが、非常に低い活性も見出された。この結果はその他の基質に就いても同様であった(結果は表示せず)。この結果はLb. helveticusが、全3 種の色素産生ペプチドに対する最高の平均活性を有することを示した。その他のペプチドに就いても、Suc−Phe−pNA を例外とする外は同様である(結果は表示せず)。【0029】Lactobacillus 類の苦味除去能を測定する為に、カゼインのトリプシン消化物の苦味除去試験を実施した(材料と方法の項参照)。図4 は6 時間以内にカゼインのトリプシン消化物の苦味を除去することのできる菌株数を示す(完全苦味除去:黒、一部除去:縦線、除去できない:白をそれぞれ示す)。特にLb. helveticusの20菌株及びLactococcus の2 菌株、Lb. casei の5 菌株は顕著な苦味除去能を示した。【0030】Lb. helveticus SBT 2171 及びその他の乳酸菌のたんぱく分解活性の比較 Lb. helveticus SBT 2171、その他高いたんぱく質分解活性を示したLactobacillus の8菌株及びLactococcus の2菌株に就いて、そのペプチダーゼ(Peptidase) 及びプロティナーゼ(Proteinase)活性を検討した。基質21種に就いての加水分解活性テストの結果は、表3に要約した。Lb. helveticus SBT 2171 は、カルボキシペプチダーゼ基質を含む、21種の基質中12種に最高活性を示した。更に、同菌株はその他大部分の基質に就いても最高の活性を有していた。特に主要ペプチダーゼの活性は Lb. helveticus SBT 2171株が最高であった。つまり、Leu−Leu−Leu(トリペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼ活性を示す) 、Lys−pNA(アミノペプチダーゼ活性を示す) 、Leu−Leu(ジペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼ活性を示す) およびMeO−Suc−Arg−Pro−Tyr−pNA(エンドペプチダーゼ活性を示す) の分解活性が他の菌株と比較して最大であった。さらに、X−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼ活性に対応るすAla−Pro−pNA 分解活性及びプロティナーゼ活性に対応するresorufin−casein分解活性に関しても二番目に高い値を示した。さらに、Lb. helveticus SBT 2171 は、Gly−Phe−βNA、Lys−Ser−4MβNA、Phe−Pro−Ala−βNA、Phe−Pro−βNA及びSer−Met−βNAを最も加水分解した(結果は表示せず)。【0031】【表3】【0032】Lb. helveticus SBT 2171 のたんぱく質分解酵素活性を、L. lactis ssp. cremoris Wg2 及びL. lactis ssp. lactis SK112 の乳酸球菌と比較すると、最も顕著な相違が認められた。例えば、Lb. helveticus SBT 2171 はLys−pNA に対して5 〜7 倍の活性を示し、Pro−pNA に対しては90倍以上の活性を、またMeO−Suc−Arg−Pro−Tyr−pNA に対しては、ほぼ10倍の活性を示した。更に、Glu−Glu を除くその他すべての基質に対してもSBT 2171菌株のほうが分解活性が高かった。これらの結果はLb. helveticus SBT 2171 が、数種の乳酸球菌を含めてテストしたすべての菌株で、最も強力なたんぱく質分解能を有する菌株であることを明瞭に示す。【0033】苦味除去活性試験は、種々の高いたんぱく質分解能を有する菌株に就いて実施した。その結果はすべての菌株が多少なりとも苦味除去活性を有することを示し、中でも Lb.helveticus SBT 2171 の活性が高かった(図5)。【0034】更にAPIZYM試験を若干の乳酸桿菌及乳酸球菌に実施した。この試験にはAPI からVIに至る59種の基質を用いた。大部分の菌株は広範な基質に対して加水分解作用を示した。APIZYM試験もLb. helveticus SBT 2171 が広範な基質に対して加水分解活性を有することを明瞭に示した (表4)。【0035】【表4】【0036】Lb. helveticus SBT 2171 のザイモグラム染色法に依るペプチダーゼ活性の検出ザイモグラム法は、Lb. helveticus SBT 2171 中に存するエキソ型ペプチダーゼ(exopeptidase)を定量する為に実施した。Lc. lactis ssp. lactis Wg2を対照菌株として用いた。表5は両菌株の無菌体抽出物の、7.5% PAGE に依る種々の基質に就いて検出された加水分解活性のRf− 値を示す。この結果はLb. helveticus SBT 2171 が、少なくとも4種の異なったペプチダーゼを有することを示した:即ち広範な基質特異性を有するアミノペプチダーゼ(aminopeptidase)、Gly−Pro−βNAに対するX−プロリル ジペプチジル アミノペプチダーゼ(X−prolyl dipeptidyl aminopeptidase)及びLeu−Leu に対する2 種の異なったジペプチダーゼ(dipeptidase) である。トリペプチダーゼ(Tripeptidase)を含む同型のペプチダーゼが Lc. lactis ssp. lactis Wg2に検出されている。しかしながら、Rf− 値はLb. helveticus SBT 2171 の酵素とは非常に異なっている。更に、L. lactis ssp. cremoris Wg2 は11種の基質中の6 種のみを加水分解し、一方、Lb. helveticus SBT 2171 はゲル中の全ての基質が加水分解可能である。これらの結果は異なったたんぱく質分解酵素がLb. helveticus SBT 2171 とLb. lactis ssp. lactis Wg2中に存することを示す。【0037】【表5】【0038】Lb. helveticus SBT 2171 の無菌体抽出物のイムノブロット法Lb. helveticus SBT 2171 及びLc. lactis ssp. lactis Wg2の無菌体抽出物中のたんぱく質はSDS−PAGEで分離され、PVDF膜上にブロットし、次いで種々の乳酸球菌のたんぱく質分解酵素に対して得たモノクローナル及びポリクローナル抗体と共に反応させた。結果を表6 に要約する。全8 種のたんぱく質分解酵素がLc. lactis ssp. lactis Wg2に存することを示した。PrtP、PepN、TRP 及び DIPに対するモノクローナル抗体及びLb. helveticus SBT 2171 との免疫反応は認められなかった。PepO及びPepCに対して生じさせたポリクローナル抗体は、Lb. helveticus SBT 2171 の無菌体抽出物中の数種のたんぱく質を認識した。しかしながら、分子量はLactococcus lactisから得た対応する酵素とは異なっているが、PepCに対する抗体は例外で、Lactococcus lactisから得たものと同様に50 kDaのたんぱく質バンドを認識した。PepX及びTRP に対するポリクローナル抗体は免疫反応を全く示さなかった。これらの結果に基づいて、Lb. helveticus SBT 2171 に由来する大部分のたんぱく質分解酵素は、少なくともLactococcus lactisに由来するたんぱく質分解酵素とは免疫学的に異なっているといえる。さらにその他の菌株のたんぱく質分解酵素とも免疫学的に異なっている (表7 参照) 。【0039】【表6】【0040】【表7】【0041】Lb. helveticus SBT 2171 の種々のペプチダーゼの部分精製図6 はLb. helveticus SBT 2171 の無菌体抽出物のイオン交換クロマトグラフィー後の溶出状態を示す。分画を採取し、種々の基質と反応させた。各基質に就いての結果は図の下に示した。図中の縦縞はペプチダーゼ活性を示し、黒は活性のピークを示す。6 種の異なったペプチダーゼ活性が分離された。即ち、1.第19分画中のLeu−Leu 加水分解ジ− またはアミノペプチダーゼ活性、2.第20分画中のPro−Ala 加水分解活性、3.第24分画中のPro−Ala 及びPro−pNA 加水分解活性、4.第26分画中のLys−pNA 、Glu−pNA 、Leu−Leu 、Leu−Leu−Leu 及びPro−pNA を加水分解可能な一般的アミノペプチダーゼ活性、5.第28及び29分画中のAla−Pro−pNA を加水分解可能なX−プロリル ジペプチジル アミノペプチダーゼ活性、6.第32及び33分画中のLeu−Leu−Leu 加水分解可能なトリまたはアミノペプチダーゼ活性である。また少なくとも3 種の異なったプロティナーゼ(Proteinase)及びエンドペプチダーゼ活性を分離した。即ち、1.第1 、23及び35分画中のresorufin−casein加水分解プロティナーゼ活性、2.第23分画中のMeO−Suc−Arg−Pro−Tyr−pNA 加水分解活性、及び第26分画中のCbz−Cys−pNA 加水分解活性である。この精製に依ってザイモグラム法の5種を超える少なくとも9種の異なったたんぱく質分解酵素が区別された。【0042】本発明では種々のLactobacillus 属から得られたたんぱく質分解活性を述べた。ペプチダーゼ類の比較研究はLactobacillus casei の亜種に就いて先に実施されている(1,2,9 )。この報告ではLactobacillus casei の僅か数種の菌株及び酵素活性が述べられていたが、一方、本発明ではLactobacillus の12菌種の178 菌株のたんぱく質分解活性を比較検討した。更に、約13種の異なったペプチダーゼ及びプロテイナーゼ活性を、20を超える異なった基質を用いて各菌株に就いて測定し、またさらに59種の基質を微量酵素APIZYMシステムを用いて測定した。本発明の結果は試験したLactobacillus 属菌株中のたんぱく質分解活性の多様な違いを明瞭に示した。たんぱく質分解性の高い菌株が存していたが、殆ど活性のない菌株も検出された。更に同一菌種の菌株のたんぱく質分解活性は大きく異なり、例えば、大部分のLb. helveticus菌株のたんぱく質分解活性は高かったが、一方Lb. helveticus SBT 0351 のたんぱく質分解活性はほとんど検出されなかった(結果は表示せず)。その他のテストした乳酸桿菌及び乳酸球菌の中では Lb. helveticus が、広範囲な基質に対して最もたんぱく質分解活性の高い菌種であった。しかも、Lb. helveticusの細胞含有抽出物を用いたトリプシンに依るβ− カゼイン消化物の反応で認められた苦味の減少は、その他の乳酸菌種より有意に高度であった。ペプチダーゼの比活性と苦味除去活性との間には明瞭な相関は認められなかったが、この現象は混合物中の苦味ペプチドの減少によるものであると説明できるだろう。【0043】種々の高度にたんぱく質分解性のLactobacillus 属菌株を選出した検討の結果、Lb. helveticus SBT 2171 が最もたんぱく質分解活性の高い菌株であることが見出された。この菌株はLys−pNA 、Arg−pNA 、Glu−pNA 、His−βNA(対応する酵素としてジェネラルアミノペプチダーゼ)、Leu−Leu (対応する酵素としてジェネラルアミノペプチダーゼ及びジペプチダーゼ) 、Leu−leu−Leu (対応する酵素としてジェネラルアミノペプチダーゼ及びトリペプチダーゼ) 、Pro−pNA 及びPro−Ala (対応する酵素としてジェネラルアミノペプチダーゼ及びプロリン イミノペプチダーゼ) 、MeO−Suc−Arg−Pro−Tyr−pNA 、Bzl−Cys−pNA (対応する酵素としてエンドペプチダーゼまたはプロティナーゼ) 、Z−Phe−Ala 、Z−Ala−Ile 及びHyp−Lys(対応する酵素としてカルボキシペプチダーゼまたはエンドペプチダーゼ) に対して最高のたんぱく質分解活性を有していた。しかし、同様に非常に高い活性がその他の基質、例えばAla−Pro−pNA (X− プロリル pジペプチジル アミノペプチダーゼ活性) 及びResorufin−casein (プロティナーゼ) に対して認められた。Lb. helveticus SBT 2171 のジェネラルアミノペプチダーゼは、Pro−pNA も加水分解する。この点はLb. helveticusに就いてはこれまで報告されていなかったので興味深い。【0044】Lb. helveticus SBT 2171 の無菌体抽出物のザイモグラム試験により、本発明の菌株が少なくとも4 種のエキソペプチダーゼを利用することを示した、即ちジェネラルアミノペプチダーゼ、X−プロリル ジペプチジル アミノペプチダーゼ及び2 種のジペプチダーゼである。同一のRf− 値を有する単一または複数の酵素が含まれる可能性があるので、これらの基質に対する加水分解作用が、単一のPepNまたは複数のPIP もしくはGAP ペプチダーゼに依るのかは不明である。もし単一のジェネラルアミノペプチダーゼのみが関与するなら、この酵素は非常に重要と見なさねばならない。数種の基質、例えばHyp−Lys 、Suc−Phe−pNA 、Moo−Suc−Arg−Pro−Tyr−pNA 及びCbz−Gly−Gly−Arg−βNA、に対するLb. helveticus SBT 2171 の無菌体抽出物に依る加水分解作用に反して、ザイモグラム染色に依ってはこれらの基質に対する活性は認められなかった。恐らく、現在ではゲルで分離される2 種以上の酵素の相乗作用が、発色群の放出に必要、またはその関与する酵素の特異的活性が、本発明における方法で検出されるには不十分であったのであろう。【0045】Lb. helveticus SBT 2171 の無菌体抽出物が、イオン交換クロマトグラフィーで分離された際には、少なくとも9種の異なったたんぱく質分解活性が判別される。ザイモグラム試験との比較では、種々のプロティナーゼ及びエンドペプチダーゼを含む5 種を超えるたんぱく質分解酵素が検出された。イムノブロット試験はLactococcus lactisから得た種々のたんぱく質分解酵素に対する抗体の大部分は、Lb. helveticus SBT 2171 の無菌体抽出物中のたんぱく質と反応しないことを示す。この点はLb. helveticusに由来する大部分のたんぱく質分解酵素は、少なくともLactococcus lactisに由来する酵素とは免疫学的に異なっていることを示す。【0046】Lb. helveticus SBT 2171 は、テストしたLactococcus 属の菌株より高いたんぱく質分解活性を示すと結論出来る。この結論は、エメンタール及びグリエールチーズ以外の大部分のチーズの熟成(19)に、主として、菌株のたんぱく質分解への主たる寄与を意味するLactococcus 属スターター培養が利用されていることを考慮すると興味深い。Lb. helveticusの様な優れたたんぱく質分解作用を有する菌株の発育がチーズの熟成に大きく影響することが明かである。従って、Lb. helveticus SBT 2171 のチーズ熟成の促進に関する適用が最も有用である。 Lb. helveticus SBT 2171 の高いたんぱく質分解活性はその固有の酵素に依るのであろうが、発現及び制御因子が関与しているかは不明である。Lb. helveticus SBT 0621 が全くたんぱく質分解活性を示さない事実は、この菌株がたんぱく質分解酵素の発現及び制御に欠けているといえるだろう。もしそうであるなら、これらの制御システムの一層の研究は非常に興味深い。【0047】チーズの熟成及びたんぱく質加水分解生成物チーズの熟成期間は、その種類に依り数週間から2 年間に及び、長期間の冷蔵保存、資本の固定化に依る高価格及び好ましからざる苦味− 臭の生成等の異常発酵に依る損失が生じる。これらの経費を低減させるために熟成工程の研究が重要性となる。この発明の一部は熟成工程に含まれる酵素系に主として寄与する乳酸菌に利用可能である。種々の起源から加水分解されたたんぱく質は、食品産業に多く使用されるが、これらは種々の疾患及び代謝異常に苦しむ患者の栄養補給にも使用できる。しかしながら、酸または酵素に依る加水分解は、目的とする栄養分の損失及び好ましからざる苦味や臭の発生の様な欠陥を多く生じる。乳酸菌からのたんぱく質分解酵素の使用は、欠陥なしに理想的な加水分解生成物を生じ得るるので、非常に重要となるであろう。【0048】Lb. helveticus SBT 2171 の乳製品発酵への意義Lb. helveticusは、発酵乳製品から1980年に分離された。Bergey’s manual of Systemic Bacteriologyに依ると、Lb. helveticus (Thermobacterium helveticum、Orla−Jensen 、1919)は、桿状、グラム陽性で、Lactobacillus 属の偏性ホモ型発酵性菌である。この乳酸菌は至適生育が45℃で、最高生育温度50〜52℃、また90% 以上の菌株はガラクトース、グルコース、ラクトース及びソルビトールの炭水化物を資化出来る(表b 参照)。Lb. helveticusは酸乳、チーズ スターター培養物及びチーズ、特にエンメンタール及びグリエールチーズから分離された(19)。Lb. helveticusは i) 食品製造に酸味を与え、従って製品の悪化を予防し、ii)たんぱく質を分解し、iii)製品に風味と味覚を生じさせ、iv)若干のLb. helveticusに依る細胞外多糖類の生成に依って製品のレオロジー特性を変える。【0049】Lb. helveticus SBT 2171 の様なlactobacillus 類のたんぱく質分解系の優れた性質は、スターターカルチャー及び熟成工程のより良いコントロールの改善に寄与出来る。Lb. helveticus SBT 2171 、その菌体抽出物及び精製たんぱく質分解酵素は、チーズの熟成促進またはいわゆる酵素調製チーズ(Enzyme Modified Cheese、EMC )の生産改善に用いられる。乳酸菌及びその(部分的)精製酵素の種々の適用に就いては、先に述べられている(10,19,20)。更に、Lb. helveticus SBT 2171 、その酵素抽出物または精製酵素は、酵素によるたんぱく質加水分解及び/またはポリペプチド材料の工程に用いられ、実質的に苦味のない加水分解生成物を生じる。Lb. helveticus SBT 2171は、種々の食品生産物の増粘剤として多糖類の生産に用いられる。更に、たんぱく質分解系または多糖類及びその他の産生に関連する遺伝子及びプラスミドの様なすべての遺伝子組情報は、理想的な発酵の特徴を現わす遺伝子組換え菌株を得る為に用いられる。一方、たんぱく質、ペプチド及び糖鎖に対して生じた抗体は、食品製造中の菌体または菌体構成物の検出に適用可能である。Lb. helveticus SBT 2171 の基礎的研究がもたらす、保健効果、抗菌剤、ファージ抵抗性、及びその他の制御並びに代謝系の研究に重要となり、一層の適用を実行すべきである。【0050】【発明の効果】異なったLactobacillus 属菌種及び菌株は、顕著な苦味除去能と同様に、多様で特異的なエキソペプチダーゼ(exopeptidase)及びエンドペプチダーゼ(endopeptidase)活性を示した。大部分のLb. helveticus菌株は、カルボキシペプチダーゼ基質を含む殆どの基質に対して非常に高い加水分解活性を示した。中でもLb. helveticus SBT 2171 は最も強力なたんぱく質分解菌株であることが見出された。ザイモグラム法及び部分精製試験を根拠として、本菌株は少なくとも9 種の異なったたんぱく質分解酵素を利用していた。Lactococcus lactis(乳酸球菌)から得た種々のたんぱく質分解酵素に対するモノクローナル及びポリクローナル抗体で、Lb. helveticus SBT 2171 から得た酵素と反応するものはなかった。このことは、Lb. helveticus SBT 2171 のたんぱく質分解系の酵素が、Lactococcus lactisから得られた酵素とは、少なくとも免疫学的に異なることを示す。本発明によると苦味、臭気等を発生することなく、高いたんぱく質分解活性をもつ乳酸桿菌及びその乳酸桿菌由来のたんぱく質分解酵素を得ることができる。得られた乳酸桿菌及びたんぱく質分解酵素は、チーズ等の乳製品あるいはたんぱく質加水分解物製造のさいに用いられ、製品の苦味、悪臭の生成を防止することができる。【0051】【引用文献】1. Arora, G., Lee, B.H. and Lamoureux, M990a. Charactenzation of enzyme profiles of Lactobacillus casei species by a rapid API ZYM system. J. Dairy Sci. 73: 264−273.2. Arora, G. and Lee, B.H. 1990b. Comparative studies on peptidases of lactobacillus casei subspecies. J. Dairy Sci. 73: 274−279.3. Arora, G. and Lee, B.H. 1991. Purification and characterization of aminopeptidase from Lactobacillus casei ssp. casei LLG. J. Dairy Sci. 75: 700−710.4. Atlan, D. Laloi, P. and Portalier R. 1990. X−prolyl−dipeptidyl aminopeptidase of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus: Charactenzation of the enzyme and isolation of deficient mutants. Appl. Environ. Microbiol. 56: 2174−2179.5. Bockelmann, W., M. Fobker and M. Teuber. 1991. Purification and characterization of the X−prolyl−dipeptidyl−aminopeptidase from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Lactobacillus acidophilus. Int. Dairy J. 1:51−66.6. Bockelmann, W., Schulz, Y. and M. Teuber. 1992. Purification and characterization of an aminopeptidase from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Int. Dairy J. 2: 95−108.7. De Man, J. C., M. Rogosa and M.E. Sharp. 1960. A medium for the cultivation of lactobacilli. J. Appl. Bacteriol. 23: 130−135.8. Doi, E, Shibata D. and Matoba T. 1981. Modified colorimetric ninhydrin methods for peptidase assay. Anal. Biochem. 118: 173−184.9. El Abboudi, M., El Soda, M., Pandian S., Barreau, M., Trepanier, G. and Simard, R.E. 1991. Peptidase activities in debittering and nondebittering strains of Lactobacilli. Int. Dairy J. 1: 55−64.10. El Soda, M. A. 1993. The role of lactic acid bacteria in accelerated cheese ripening. submitted for publication (FEMS) for the 4th Symposium on Lactic Acid Bacteria, Noordwijkerhout, The Netherlands.11. Elleman, T. C. 1974. Aminopeptidases of Pea. Biochem. J. 141: 113−118.12. Exterkate, F.A. 1975. An introductory study of the proteolytic system of Streptococcus cremoris strain HP. Neth. 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Dairy J. 2: 345−363.【図面の簡単な説明】【図1】種々のLactobacillus 属及びLactococcus 属の乳酸菌の基質、Lys−pNA に対するたんぱく質分解活性の平均を示す。【図2】種々のLactobacillus 属及びLactococcus 属の乳酸菌の基質、Ala−pNA に対するたんぱく質分解活性の平均を示す。【図3】種々のLactobacillus 属及びLactococcus 属の乳酸菌の基質、Meo−Suc−Arg−Prp−Tyr−pNA に対するたんぱく質分解活性の平均を示す。【図4】種々の乳酸菌によるカゼイン消化物の苦味度の低減を示す。【図5】種々のLactobacillus 属菌株の菌体抽出物による加水分解に基づく、カゼインのトリプシン消化物の苦味度を示す。【図6】本発明のラクトバチルス ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus) SBT 2171のモノQ イオン交換カラム分画物のペプチダーゼ活性を示す。 次の性質を示す受託番号 FERM BP-5445であるラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus) SBT 2171またはその変異株;(1)高たんぱく質分解活性を有する(2)6時間以内にカゼイントリプシン加水分解物の苦味を除去する 活性を有する(3)著しく高いプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する(4)著しく高いジェネラルアミノペプチダーゼ活性を有する。 醗酵工程において請求項1の微生物を利用する方法。 醗酵工程がチーズの熟成工程である請求項2による方法。 請求項1の微生物を生理活性ペプチドの分解に利用する方法。 請求項1の微生物が、乳酸桿菌が通常生育する条件下で乳から得られた調製物の存在下で生育する、乳から得られた調製物の醗酵方法。 乳調製物が新鮮なチーズカードである請求項5による方法。


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